Lorsqu’un poste de gardien au Musée d'histoire naturelle de New York se présente, Larry Daley, père divorcé butinant d’un emploi à l’autre, saute sur l’occasion, espérant du coup regagner l’estime de son fils. Parrainé par les doyens de l’établissement, à l’aube de la retraite, le nouvel employé se familiarise avec l'endroit. Ce dont on ne l'informe pas, c'est que lorsque la nuit tombe, les divers animaux empaillés, mannequins d’apparence humaine et autres maquettes prennent vie.
Littéralement. Grâce aux conseils de l'un de ces personnages, l’ex-président des États-Unis Teddy Roosevelt, Larry parvient à rétablir un semblant de contrôle. Mais il n’est pas au bout de ses peines.